甲基化会发生在中心法则的三个层面:DNA,RNA,蛋白。只是RNA甲基化量相比DNA少很多,直到近几年微量建库技术的成熟后RNA甲基化才逐渐开始在二代测序平台上开展。如果采用常规建库流程,细胞量要达到108级别(毫克级别的tatol RNA)。如果采用微量建库细胞数106就可以开展实验,甚至可以做到105细胞数(2-3ug的total RNA)。为了进一步降低样本其实量,并且增加实验的稳定性,用于m6A富集实验不在使用mRNA,而是直接用total RNA,富集下来的RNA叠加用SMART扩增,这时候rRNA的比例大概20-30%,如果可以接受的话就可以不用去核糖体,如果觉得核糖体比例过高,可以在SMART扩增之后进行去rRNA(和常规实验流程不一样,常规实验流程使先去rRNA,然后在建库)。另外可以根据信噪比情况可以进行第二轮,甚至第三轮RIP。
我们基于以上情况搭建了自己的m6A实验流程,经测试流程稳定可靠。除此之外的呢,如果把抗体替换一下还可以做其他类型的RNA修饰,比如m5C,m1A,m7G,ac4C。期待和各位老师进行合作。
[1] Fu Y , Dominissini D , Rechavi G , et al. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(5):293-306.
[2] Meyer K , Saletore Y , Zumbo P , et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.[J]. Cell, 2012.
[3] Picelli S , Faridani O R , Bjrklund S K , et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols, 2014, 9(1):171-181.
[4] Zeng Y , Wang S , Gao S , et al. Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials[J]. PLoS Biology, 2018, 16(9):e2006092.
Ribo-seq