甲基化会发生在中心法则的三个层面：DNA，RNA，蛋白。只是RNA甲基化量相比DNA少很多，直到近几年微量建库技术的成熟后RNA甲基化才逐渐开始在二代测序平台上开展。如果采用常规建库流程，细胞量要达到10⁸级别（毫克级别的tatol RNA）。如果采用微量建库细胞数10⁶就可以开展实验，甚至可以做到10⁵细胞数（2-3ug的total RNA）。为了进一步降低样本其实量，并且增加实验的稳定性，用于m6A富集实验不在使用mRNA，而是直接用total RNA，富集下来的RNA叠加用SMART扩增，这时候rRNA的比例大概20-30%，如果可以接受的话就可以不用去核糖体，如果觉得核糖体比例过高，可以在SMART扩增之后进行去rRNA（和常规实验流程不一样，常规实验流程使先去rRNA，然后在建库）。另外可以根据信噪比情况可以进行第二轮，甚至第三轮RIP。

我们基于以上情况搭建了自己的m6A实验流程，经测试流程稳定可靠。除此之外的呢，如果把抗体替换一下还可以做其他类型的RNA修饰，比如m5C，m1A，m7G，ac4C。期待和各位老师进行合作。

[1] Fu Y ,  Dominissini D ,  Rechavi G , et al. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation[J]. Nature Reviews Genetics, 2014, 15(5):293-306.

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Ribo-seq