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Ribo-seq

生命的载体和执行者是蛋白,信息储存在DNA中,而RNA是信息流出的管道。在生命的研究中蛋白是最直接的目标,但是苦于蛋白无法直接用来进行测序(当然可以用来打质谱),所以可以用RNA-seq的数据来推测,但是RNA和蛋白的水平有时候并不是线性关系(存在着翻译调控)。为了解决RNA和蛋白的关系问题,Ribo-seq(翻译组学)作为一个折中的策略来推测翻译出的开放阅读框,相比于直接进行RNA-seq能更有效的推测翻译的多肽或者蛋白的水平,当然也可以根据Ribo-seq数据计算出的elongation速率来推测翻译的效率从而在翻译水平上进行生物学研究。实验流程:1.细胞裂解2.酶消化3.ribosome分离4.footprint分离纯化5.建库测序。Ribo-seq注意事项:1.RNA酶消化后的片段非常短30nt,因此在纯化建库的时候要注意2.核糖体富集方法主要有:密度梯度离心;分子筛3.为了稳定核糖体mRNA复合体增强footprint的信号可以用翻译延伸因子抑制剂放线菌酮处理,但是这会增强pause的信号从来造成bias。4.buffer中的盐离子和金属离子对footprint的结果会产生影响,但是对表达定量的影响不是特别大。

宸谱生物根据文献的整合搭建了稳健的实验流程,期待和老师进行合作。

[1]Ingolia,  Nicholas T . Ribosome Footprint Profiling of Translation throughout the Genome.

[2] Ingolia N T ,  Brar G A ,  Rouskin S , et al. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.[J]. Nature Protocols, 2012, 7(8):1534-1550.

[3] Fremin B J ,  Nicolaou C ,  Bhatt A S . Simultaneous ribosome profiling of hundreds of microbes from the human microbiome[J]. Nature Protocols, 2021:1-16.

[4] Heesch S V ,  Witte F ,  Schneider-Lunitz V , et al. The Translational Landscape of the Human Heart[J]. Cell, 2019, 178(1).

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